免疫細胞化學 (ICC) 是一種使用熒光抗體或染料來檢測細胞內靶抗原的技術。那么免疫細胞(ICC)實驗常見問題有哪些?讓我們一起來看看吧!
一、熒光信號弱
1. 樣品質量
選用新鮮制備的樣本以及適當?shù)谋3謼l件。
2. 靶標豐度低
適當提高一抗?jié)舛取?/span>
選擇熒光強度更強的二抗。
3. 固定方法不當
甲醛和蛋白的氨基通過共價鍵結合,可能會遮蓋抗原表位,導致靶表位信號減弱。建議調整抗原修復方法或固定方法。
多聚甲醛會與GFP熒光蛋白發(fā)生醛化反應,導致信號減弱。
檢測膜蛋白一般不建議使用甲醇或丙酮固定,有機溶劑能夠破壞膜結構。
4. 透化方法不當
檢查靶標蛋白表達位置,胞內蛋白需要透化處理。
膜蛋白需要考慮所檢測靶表位位于膜內還是膜外,膜外則不需要透化。
5. 信號放大不夠
如果檢測靶點是低豐度蛋白.信號弱可能是由于信號放大不足導致的,可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信號放大技術,進一步增強信號,實現(xiàn)低豐度,難以檢測蛋白的檢測。
二、背景太高
1. 封閉不足
(1)選用二抗種屬來源的血清封閉。
(2)選用鏈霉親和素/生物素系統(tǒng),需要用鏈霉親和素封閉內源的生物鏈酶。
(3)選用HRP系統(tǒng),需要使用過氧化氫等商業(yè)化試劑盒去活化內源性HRP。
(4)選用AP系統(tǒng),需要使用左旋咪唑等商業(yè)化試劑去活化內源性磷酸酶。
2. 一抗
一抗?jié)舛冗^高,減少用量
3. 二抗
(1)設置無一抗對照,幫助確認背景是否來源二抗。
(2)二抗?jié)舛冗^高,減少用量。
(3)抗體凝聚,使用二抗前離心去掉抗體凝聚物。
(4)使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗,信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。
4. 自發(fā)熒光
(1)設置自發(fā)熒光對照,確定是否自發(fā)熒光。
(2)固定劑如醛類和氨基共價結合導致的自發(fā)熒光,可用硼氫化na去除。
(3)增加固定劑的漂洗次數(shù)。
(4)避開背景高的波段,選用背景較低的波段檢測。
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