1970年,科學家發(fā)現(xiàn)了mRNA的5’端結構——帽子結構(m7GpppN),它一方面保護mRNA使其具有穩(wěn)定性,另外一方面,5′端帽子還是前體mRNA剪接、多聚腺苷酸化及和核輸出的標識符。同時,mRNA的5′端帽子結構如果出現(xiàn)異常,將會引起細胞發(fā)生抗病毒反應。因此,RNA加帽和mRNA的擴增,促進了mRNA的大規(guī)模生產,mRNA疫苗成為可能。
一、mRNA加帽原理
真核生物mRNA加帽需要在TPase、GTase、N7 MTase等酶的參與下合成帽子結構,原理如下:
(1)RNA三磷酸酶(TPase)從5’-三磷酸中去除 γ-磷酸,生成 5’-二磷酸 RNA
pppN1(p)N.-OH(3')→ ppNi(pN)x-OH(3')+Pi
(2)RNA 鳥苷酸轉移酶(GTase)通過賴氨酸-GMP 共價中間體將 GMP 基團從 GTP 轉移到 5’-二磷酸
ppN1(pN)x-OH(3')+GTP→G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+PPi
(3)嘌呤-N7 甲基轉移酶(鳥嘌LING-N7 MTase)在鳥嘌LING帽的N7胺上添加一個甲基,形成基本帽結構(Cap0)
G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc
(4)m7G 特異性 2’O-甲基轉移酶(mRNA Cap 2′-O-Methyltransferase)還可將核糖2’O位置的核糖核苷酸甲基化生成Cap1結構
m7GpppN1(pN)x-OH(3')+AdoMet → m7Gppp[m3'-o]N1(pN)x-OH(3')+ AdoHyc
Cap 0 RNA Cap 1 RNA
二、RNA加帽酶的應用
1. 促進靶蛋白的表達
mRNA是蛋白質合成的模板,因此,將mRNA導入細胞,促進胞內蛋白的表達。
2. 促進Cap0/Cap1的RNA合成
根據上述mRNA的加帽原理,合成Cap0/Cap1結構的mRNA。
3. 合成mRNA疫苗
三、加帽方法
1. 酶法加帽
利用上述的加帽原理,即可獲得Cap0/Cap1結構。北京百奧創(chuàng)新科技有限公司提供的CellScript加帽試劑盒(貨號:C-SCCS1710)的反應時間短,加帽效率高(接近100%),同類產品可直接交叉使用。
2. 共轉錄法加帽
轉錄起始,加入帽類似物,轉錄本沿著帽類似物延長,轉錄完成形成的mRNA就具有帽子結構。